Mennesket. Peter K. A. Jensen

Чтение книги онлайн.

      Princippet i PCR-teknikken.

      En meget anvendt metode til kloning af gener baserer sig på opdagelsen i 1970 af enzymet revers transkriptase. Revers transkriptase udnyttes af såkaldte RNA-virus (HIV, der forårsager AIDS, er ét eksempel) til af danne DNA ud fra RNA. Revers transkriptase er f.eks. blevet udnyttet til kloning af genet for human insulin (se nedenfor). Princippet er, at mRNA repræsenterende det ønskede protein (f.eks. insulin) isoleres fra bugspytkirtlens insulinproducerende celler. Ved hjælp af revers transkriptase dannes et komplementært DNA-molekyle (cDNA) ud fra mRNA. Det erindres, at alle introner er fjernet fra mRNA, hvorfor cDNA udelukkende består af kodende sekvenser (se videre i kapitel 2). Herefter indsættes cDNA i en vektor og opformeres som vist i figur 1-5.

      Det første humane protein, der blev fremstillet ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi i kommercielt (og terapeutisk) øjemed, var insulin, der blev produceret af verdens første bioteknologiske firma, Genentech (dannet 1976), med henblik på behandling af sukkersyge. Produktet kom i handelen i 1982. Et kvart århundrede senere er genteknologien blev en rutinedel af ethvert større farmaceutisk firma. Genteknologien giver mulighed for at producere humane proteiner i store mængder, som det ellers ville være overordentlig vanskeligt at bringe til veje. I mange tilfælde er de genteknologisk fremstillede proteiner sikrere at anvende i såvel terapeutisk som diagnostisk øjemed.

      Kloning af DNA-sekvenser (gener) var dog stadig en besværlig og langvarig proces indtil udviklingen af polymerasekædereaktionen (PCR, Polymerase Chain Reaction). PCR-teknikken, der blev opfundet af amerikaneren Kary Mullis i 1983, er en simpel teknik til at mangfoldiggøre (amplificere) et bestemt segment af et DNA-molekyle (figur 1-6). Hertil anvendes to små enkeltkædede DNA-molekyler (f.eks. på tyve nukleotider hver), såkaldte primere. Primernes basesekvens svarer til områder, der flankerer det segment af DNA-molekylet, som vi er interesseret i at få mangfoldiggjort. Primerne tilsættes opløsningen med vores DNA, hvorefter opløsningen opvarmes til 95 °C. Herved adskilles DNA-molekylets to kæder, og de to primere vil herefter finde og binde sig til de sekvenser på de adskilte DNA-kæder, der er komplementære til primernes sekvens. Der er nu dannet to små “øer” på tyve nukleotider af dobbeltkædet DNA. DNA-polymerase, det enzym, der kopierer DNA ved at inkorporere nye nukleotider i de komplementære positioner langs DNA-kæden, vil kun starte sin aktivitet, hvor DNA allerede er dobbeltkædet. DNA-polymerase vil derfor starte ved de ovennævnte små dobbeltkædede “øer”. Polymerasen laver med andre ord en kopi af den del af DNA-molekylet, der ligger mellem de to primere, altså af det ønskede DNA-segment. Når processen er afsluttet, har vi således to kopier af det ønskede DNA-segment. Hele processen kan nu gentages, og hver cyklus fører til en fordobling af den allerede eksisterende mængde af det pågældende segment. Efter f.eks. 35 runder har vi 2³⁵ = ca. 34 millioner kopier. Hvad der startede som en opløsning af enkeltstrenget DNA, primere, polymerase og frie nukleotider ender med at blive en koncentreret opløsning af det ønskede DNA-segment.

      Genkortlægning ved hjælp af markør-analyse. En forælder bærer et dominant virkende sygdomsgen på sit ene kromosom (det paternelle kromosom, som forælderen har arvet fra sin far). Sygdomsgenets lokalisation på det pågældende kromosom er ukendt, men dets position kan fastlægges ved hjælp af et antal genetiske markører, der ligger spredt på kromosomet. Hvis sygdomsgenet og en given markør ligger langt fra hinanden på kromosomet vil dette afspejles ved stor rekombinationshyppighed. Modsat hvis markør og sygdomsgen ligger meget tæt på hinanden: Her vil rekombination kun sjældent (evt. aldrig) finde sted. Rekombinationshyppigheden kan bruges som et mål for afstand mellem sygdomsgen og pågældende markør. Måleenheden er centimorgan.

      Stamtræ fra familie med autosomal dominant arvelig muskelsvind. Firkanter er mænd, cirkler er kvinder. Den røde farve angiver, at vedkommende person er syg. De farvede bjælker angiver markører.

      Cohen-Boyer-metoden til molekylær kloning ved hjælp af bakterier (jf. ovenfor) er sammenlignet med PCR-teknikken kompliceret og tidrøvende. Den simple, automatiserede PCR-teknik kan derimod i løbet af få timer generere millioner af kopier af den ønskede DNA-sekvens.

      DNA-undersøgelse for arvelige sygdomme

      Genetisk betingede (“arvelige”) sygdomme inddeles traditionelt i tre hovedkategorier: 1. Sygdomme der skyldes en defekt (mutation) i et enkelt gen (de såkaldt monogene eller mendelske sygdomme, se figur 1-2); 2. Sygdomme der opstår som følge af et samspil mellem et større eller mindre antal disponerende gener og et antal (mere eller mindre kendte) miljøfaktorer (de såkaldt multifaktorielle sygdomme); 3. Kromosomsygdomme, der skyldes afvigelser ved antallet eller strukturen af et eller flere kromosomer (f.eks. Downs syndrom). Nogle inkluderer en fjerde kategori af sygdomme, der opstår som følge af mutationer i legemsceller (såkaldte somatiske mutationer), der dog ikke nedarves (f.eks. cancersygdomme).

      I det følgende skal kort omtales anvendelsen af DNA-teknologiske metoder til diagnostik af monogene sygdomme, hvor mutationer i enkelte gener betinger eller disponerer til sygdommen. For mange geners vedkommende kender man blot deres lokalisation på kromosomerne (eller i mitokondrie-genomet). I sådanne tilfælde vil indirekte genetisk diagnostik (koblingsdiagnostik) ofte være muligt. Men for et hastigt stigende antal geners vedkommende gælder det, at ud over kendskab til deres præcise lokalisation på kromosomerne, er det lykkedes at klone det pågældende gen og karakterisere dets struktur fuldstændigt, dvs. genets basesekvens er kendt. I disse tilfælde er direkte mutationsundersøgelse mulig.

      Koblingsanalyse

      Koblingsanalyse blev oprindeligt anvendt til at lokalisere gener på kromosomer (figur 1-7), men samme teknik har senere vist sig særdeles anvendelig til diagnostik af arvelige sygdomme i familier (figur 1-8). I tilfælde hvor sygdomsgenets lokalisation på kromosomerne er kendt, men den sygdomsfremkaldende mutation er ukendt, kan indirekte DNA-undersøgelse anvendes i diagnostisk øjemed. Denne form for indirekte diagnostik kaldes koblings- eller markøranalyse. Princippet i koblingsanalyse er simpelt: I stedet for at undersøge selve sygdomsgenet følger man nedarvningen af et antal DNA-sekvenser (markører, se kapitel 2), der vides at være lokaliseret meget nær ved genet (er tæt koblet til genet). Det er vigtigt, at koblingen er meget tæt for at minimere risikoen for rekombination mellem markørerne og sygdomsgenet under meiosen (se figur 2-8).

      I figur 1-8 er vist et stamtræ med forekomst af СКАЧАТЬ