Клиническая патофизиология. Коллектив авторов

Чтение книги онлайн.

      Этапы исследования:

      1) использование скрининговых программ диагностики (например, тонкослойной хроматографии, электрофореза, микробиологических методов);

      2) применение подтверждающих методов (например, флюорометрических, спектрофотометрических, количественного определения метаболитов, тестирования активности фермента).

      Молекулярная диагностика. При помощи методов ДНК-диагностики устанавливают последовательность расположения отдельных нуклеотидов, выделяют гены и их фрагменты, устанавливают их наличие в изучаемых клетках. К числу наиболее эффективных методов относятся гибридизация ДНК (блоттинг, in situ), клонирование ДНК, полимеразная цепная реакция.

       Гибридизация ДНК. Для определения порядка расположения нуклеотидов в исследуемом генетическом материале изучаемую ДНК помещают в специальную среду, где происходит контакт ДНК с нитями другой нуклеиновой кислоты. В случае комплементарности каких-либо двух нитей происходит их «сшивка». При специальных исследованиях используют генетические «зонды» – фрагменты меченной радиоактивным изотопом однонитевой ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.

       Блот-гибридизация. Для выявления интересующих (в том числе мутантных) генов ДНК подвергают рестрикции. Полученные фрагменты ДНК подразделяют по молекулярной массе, денатурируют и переносят на носитель (нейлоновую или иную мембрану). Фиксированную на носителе в виде пятна ДНК гибридизируют с меченым радиоактивным изотопом ДНК- или РНК-зондом. В результате определяют положение аномального фрагмента ДНК.

       Клонирование ДНК. С помощью специализированных ферментов (ДНК-рестриктаз) разрезают нить ДНК на отдельные группы генов или на единичные гены. Для изучения признаков (в том числе патологических), кодируемых данными генами, особенностей транскрипции и трансляции создают нужное количество копий данного гена.

       Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР (специфическая амплификация небольшого участка ДНК) применяют для изучения регионов предполагаемых мутаций и других особенностей структуры ДНК. Для исследования можно использовать любой биологический материал, содержащий ДНК (например, кусочек ткани, содержащий каплю или пятно крови, смыв полости рта, луковицу корня волос). На первом этапе исследуемую ДНК расщепляют на две нити при нагревании до 95 – 98 °C. Затем одну из нитей гибридизируют и стимулируют синтез последовательности, комплементарной исследуемой ДНК (с помощью термофильной ДНК-полимеразы). Циклы реакции повторяют до накопления нужного количества ДНК. Эту методику разработал и предложил Кэри Муллис.

      Биологическое моделирование. Биологическое моделирование проводят для анализа возможных генетических дефектов человека с использованием в качестве объекта исследования животных (здоровых или мутантных), а также для изучения возможных мутагенных и тератогенных эффектов лекарственных средств СКАЧАТЬ