HPLC optimal einsetzen. Группа авторов

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СКАЧАТЬ daher beschränkt sich dieses Kapitel auf die Aspekte, die in der LC-MS-Analytik besonders zu beachten sind oder eine andere Gewichtung erfahren müssen.

3.2.1.1 Optimierungsziel Empfindlichkeit/Nachweisgrenze – welche Trennsäule nehmen?

Ein wesentlicher Unterschied in der LC-MS-Analytik im Vergleich zu konventionellen HPLC-Methoden liegt in der maximalen Flussrate, die zur Trennung verwendet werden kann. Dies liegt in der Ionenquelle des Massenspektrometers begründet, die pro Zeit nur eine begrenzte Menge an mobiler Phase in die Gasphase überführen und quantitativ von den Analytmolekülen entfernen und von dem Innenleben des Massenspektrometers fernhalten kann. Elektrosprayionisation (ESI), die in über 80 % aller publizierten Online-LC-MS-Kopplungen eingesetzt wird (gefolgt von AP-CI mit über 16 %), lässt sich mit pneumatischer Unterstützung eines Vernebelungsgases im Flussbereich von etwa 50–300 μl/min bei bestmöglicher Empfindlichkeit betreiben. Alle kommerziellen ESI-Quellen (mit Ausnahme von Nanosprayquellen) verkraften auch deutlich höhere Flussraten von bis zu 1 ml/min und darüber, wobei zahlreiche Beispiele in der Literatur belegen, dass die Empfindlichkeit von ESI-Methoden erst dann zu leiden beginnt, wenn es nicht mehr gelingt, die Menge an mobiler Phase effektiv zu entfernen, es mithin „die eine“ magische Obergrenze der Flussrate in der LC-MS-Analytik nicht gibt. Viele LC-MS-Analytiker:innen setzen trotzdem lieber auf eine konservativ niedrige LC-Flussrate bis maximal 300–500 μl/min, statt sich an der optimalen Lineargeschwindigkeit für die gegebenen LC-Trägerpartikel, sprich, dem Minimum der van-Deemter-Kurve, zu orientieren. Um die LC-Trennung dennoch möglichst effizient zu betreiben, überschreiten die Säuleninnendurchmesser für LC-MS-Applikationen deshalb 2,1 mm nicht. Eine UHPLC-Säule dieses Durchmessers und eines mittleren Teilchendurchmessers des Phasenmaterials d_p von 2 μm hat ihre optimale Lineargeschwindigkeit in grober Näherung bei rund 5,5 mm/s, was bei einer 2,1 mm-ID-Säule bereits einer Flussrate von etwa 1,1 ml/min entspricht. In der Praxis reduzieren viele LC-MS-Anwender:innen diese Flussrate, um die Trocknungsleistung der Ionenquelle nicht zu überfordern, auch wenn die LC-Trennung dann bereits mit tendenziell zu hohem Einfluss der Longitudinaldiffusion (B-Term) gefahren wird. Eine Reduktion des Säuleninnendurchmessers auf 1 mm wird aus mehreren Gründen kontrovers diskutiert, auch wenn sich viele Anwender:innen von dem kleineren Innendurchmesser eine niedrigere Nachweisgrenze versprechen, da die Probenmoleküle in einem kleineren Peakvolumen verdünnt würden. Eine ausführlichere Erörterung dieser Problematik kann der Literatur entnommen werden [2]. Kurz gesagt kann mit konzentrationsempfindlichen Detektoren (insbesondere ESI wird als bevorzugt konzentrationsempfindlicher Prozess beschrieben) bei Anwendung der Skalierungsgesetze der Chromatographie auf einer 2,1 mm-ID-Trennsäule dieselbe Nachweisgrenze erreicht werden wie auf einer 1 mm-ID-Trennsäule, sofern man das 4,4-fache Probenvolumen injiziert. Technisch sind Trennungen auf 2,1 mm-ID-Säulen allerdings robuster als jene auf 1 mm-ID-Säulen, was sowohl am verwendeten Säulenmaterial als auch an der begrenzten Eignung von UHPLC-Systemen für sehr niedrige Flussraten von weniger als 50 μl/min liegt. Damit bleiben für die Verwendung von 1 mm-ID-Trennsäulen nur zwei Gründe übrig: Man ist entweder derart limitiert in der Probenmenge, dass Injektionsvolumina von 4–5 μl pro Messung zu viel Probenmenge verbrauchen, oder die MS-Ionenquelle beschränkt den Anwender tatsächlich auf Flussraten von etwa 100 μl/min oder weniger. Letzteres kommt in der Praxis allerdings selten vor. Kommerzielle ESI-Quellen mit pneumatischer Vernebelung kommen in der Regel mit Flussraten bis zu 600–700 μl/min ohne Einbußen in der Empfindlichkeit gut zurecht. APCI ist mit höheren Flussraten prinzipbedingt noch besser kompatibel, da es einer Mindestflussrate von etwa 200 μl/min bedarf, um ausreichend Eluent zur Bildung des Reaktantgases in der APCI-Quelle zu verdampfen.

      Empfehlungen

       • Beim korrekten Skalieren von LC-Trennungen über verschiedene Säulendurchmesser entsteht bei konzentrationsempfindlichen Detektoren wie ESI-MS kein nennenswerter Empfindlichkeitsgewinn.

       • Für die meisten LC-MS-Trennungen sind Säuleninnendurchmesser von 2,1 mm ausreichend; selbst UHPLC-Phasenmaterialien von dp ≤ 2 μm können in aller Regel noch an oder nahe ihrem Effizienzoptimum betrieben werden.

       • Innendurchmesser von unter 2,1 mm sind nur in zwei Fällen unersetzlich, bei erheblich limitiertem Probenvolumen und/oder drastisch reduzierten Flussraten von unter 100µl/min. wegen technischer Randbedingungen wie dem Design der MS-Ionenquelle.

3.2.1.2 Optimierungsziel Auflösung gegenüber Probendurchsatz

      Wie bei der Entwicklung und Optimierung einer konventionellen HPLC-Methode auch, stellt sich bei LC-MS-Methoden eingangs die Frage nach dem Ziel, das die Trennmethode mit MS-Detektion verfolgt. Je nach Anzahl der vorhandenen Probenbestandteile und der Güte der analytischen Information steht eine LC-MS-Trennung wie jede andere LC-Trennung auch in dem Spannungsfeld zwischen möglichst viel analytischer Information und möglichst kurzer Analysenzeit, oder anders ausgedrückt: so viel analytische Information wie nötig in so kurzer Analysenzeit wie möglich. Schnelle Trennungen gehen dabei mit einem gewissen Verlust an analytischer Information in Form von Auflösung einher. Leicht einsichtig wird dies, wenn man sich die Peakkapazität – bei Gradienttrennungen definiert als der Quotient aus der Gradientzeit und der durchschnittlichen Peakbasispeakbreite – relativ zum Gradientvolumen [3] als Produkt aus Gradientdauer und Flussrate betrachtet.

      Abbildung 3.1 veranschaulicht anhand eines UHPLC-Anwendungsbeispiels, wie sich die Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, hier der einfacheren Übertragbarkeit wegen ausgedrückt als das Vielfache des Säulenvolumens, ändert. Es ergibt sich, dass die Peakkapazität einer Gradienttrennung mit steigendem Gradientvolumen zunächst steil ansteigt und dann einer Sättigung entgegenstrebt. Gemäß dem sich daraus ableitenden Gradientvolumenkonzept sind schnelle Trennungen, die durch kleine Gradientvolumina auf kleinlumigen und kurzen Säulen erreicht werden, damit begrenzt in ihrer Trennleistung und eignen sich daher bevorzugt für Screening-Experimente. Zusätzlichen Nutzen bietet hier das Massenspektrometer als weitere Trenndimension, indem es auch potenziell koeluierende Substanzen noch hinreichend voneinander getrennt zu detektieren und – mit gewissen Einschränkungen – zu quantifizieren vermag. Eine vollständige Basislinientrennung ist somit bei der MS-Detektion je nach verwendetem Massenspektrometer zur Quantifizierung nicht so unbedingt erforderlich wie in der konventionellen HPLC. Möglichst hohe Peakkapazitäten erfordern größere Gradientvolumina, längere Säulen und damit längere Laufzeiten.

Letzteres ist apparativ mit der Massenspektrometrie gut zu bewältigen. Bei schnellen Screening-Trennungen hingegen wirken zwei Einschränkungen: Erstens können sich zu viele koeluierende Substanzen während ihrer Ionisierung in der Ionenquelle gegenseitig behindern (Konkurrenzionisation) und damit das quantitative Resultat verfälschen. Zweitens benötigt nahezu jedes Massenspektrometer für jedes einzelne zu messende Masse-zu-Ladungsverhältnis eine gewisse Zeitspanne (Cycle Time), die die Datenrate begrenzt. Schnelle UHPLC-Trennungen überfordern bis heute noch viele Massenspektrometer mit ihrer Geschwindigkeit: Peakbreiten von 5 s und darunter können je nach Gerät zu gering sein, um alle gewünschten Massensignale so rasch abzutasten, dass die für eine statistisch belastbare Quantifizierung gewünschte Anzahl von 25 Datenpunkten pro Peak oder mehr tatsächlich erzeugt werden kann. In den meisten Fällen begnügt man sich zur Quantifizierung daher bereits mit rund 10 Datenpunkten. Nichtsdestotrotz kann es bei der Methodenentwicklung nötig sein, weniger effiziente Trennungen (d. h. breitere Peaks) und mehr Auflösung durch Selektivität zu erzeugen als die Chromatographie prinzipiell zuließe, damit die Massenspektrometrie bei der Datenerzeugung Schritt halten kann. Ein Fall aus der Praxis sind Quantifizierungen in komplexen Proben mittels Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern, die die erforderliche Selektivität der Detektion mit Tandem-MS im SRM-Modus bereitstellen. Je mehr SRM-Übergänge, gegebenenfalls für überlappende Substanzzonen, das Massenspektrometer abarbeiten muss, umso größer wird die Cycle Time und entsprechend geringer die Datenrate. Ein Ausbremsen der Chromatographie kann je nach MS-Typ und Gerätegeneration СКАЧАТЬ